Ligation-Rechner

Kategorie: Biologie
- 04. April 2025
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Vektor-DNA

Insert-DNA

Ligation Reaktionssetup

Empfohlene Insert-Menge
8.3 ng
0.33 μL Insert-Stamm
Vektormenge
50 ng
Verwendung von 1 μL Vektor-Stamm
Insert:Vektor Verhältnis
3:1 (molar)
Optimal für Standardklonierung

Komplettes Reaktionssetup

Komponente Volumen (μL) Endmenge
Vektor-DNA (50 ng/μL) 1.0 50 ng
Insert-DNA (25 ng/μL) 0.33 8.3 ng
10× T4 DNA-Ligase Puffer 2.0 1×
T4 DNA-Ligase 1.0 400 U
Nukleasefreies Wasser 15.67 Auf 20 μL
Gesamtvolumen 20.0

Optimierungstipps

Basierend auf Ihren Eingabeparametern hier einige Empfehlungen:

  • Für 5' sticky ends mit einem Vektor:Insert Verhältnis von 1:3, inkubieren bei 16°C für 4 Stunden.
  • CIP-Behandlung des Vektors hilft, den Hintergrund der Selbstligatur zu reduzieren.
  • Wenn die Transformationsrate niedrig ist, versuchen Sie, das Insert:Vektor Verhältnis auf 5:1 zu erhöhen.
  • Für stumpfe Endligationen erhöhen Sie die Ligasekonzentration und verlängern Sie die Ligationzeit.
  • Inaktivieren Sie die Ligase bei 65°C für 10 Minuten vor der Transformation für die besten Ergebnisse.

Über DNA-Ligation

  • DNA-Ligation umfasst das Verbinden von DNA-Fragmenten durch die Bildung von Phosphodiesterbindungen.
  • T4 DNA-Ligase benötigt ATP und Mg²⁺, um richtig zu funktionieren (bereitgestellt im Ligationpuffer).
  • Sticky-End-Ligationen sind effizienter als stumpfe Endligationen.
  • Vektor:Insert molare Verhältnisse liegen typischerweise zwischen 1:3 und 1:5 für die Standardklonierung.
  • Höhere Insert:Vektor Verhältnisse (3:1 bis 10:1) werden für stumpfe Endligationen oder größere Inserts empfohlen.
  • Dephosphorylierung von Vektoren (unter Verwendung von CIP, SAP usw.) verhindert die Selbstligatur des Vektors.
  • Schnelle Ligasesysteme können die Ligation auf 5-15 Minuten bei Raumtemperatur reduzieren.

Formel für die Einfügemenge (ng):

\[ \text{Einfügemenge ng} = \left( \frac{\text{Vektor ng} \times \text{Einfügelänge in kb}}{\text{Vektorlänge in kb}} \right) \times \left( \frac{\text{Einfügemolen}}{\text{Vektormolen}} \right) \]

Was ist der Ligation Rechner?

Der Ligation Rechner ist ein Werkzeug, das Forschern hilft, die geeignete Menge an Vektor- und Insert-DNA für eine erfolgreiche Ligation zu bestimmen. Die DNA-Ligation ist ein kritischer Schritt im molekularen Klonen, bei dem ein DNA-Insert mit einem Plasmidvektor unter Verwendung eines Enzyms namens DNA-Ligase verbunden wird.

Wie funktioniert es?

Dieser Rechner ermöglicht es den Benutzern, Details zu ihrem Vektor und Insert einzugeben, einschließlich Länge und Konzentration. Basierend auf dem gewählten molaren Verhältnis berechnet er die erforderliche Menge an Insert-DNA, um eine optimale Ligation zu erreichen.

Wichtige Funktionen

  • Berechnet molare Verhältnisse von Vektor zu Insert für verschiedene Klonierungsszenarien.
  • Unterstützt sowohl standardisierte als auch benutzerdefinierte molare Verhältnisse.
  • Gibt Empfehlungen für Ligationbedingungen basierend auf klebrigen oder stumpfen Enden.
  • Beinhaltet Optimierungstipps zur Verbesserung der Ligationseffizienz.

Wie benutze ich den Rechner?

  1. Geben Sie die Vektorlänge (bp) und Konzentration (ng/μL) ein.
  2. Geben Sie die Einfügelänge (bp) und Konzentration (ng/μL) ein.
  3. Wählen Sie das gewünschte molare Verhältnis von Vektor zu Insert (z. B. 1:3, 1:5).
  4. Geben Sie das gesamte Reaktionsvolumen an (z. B. 20 μL).
  5. Für erweiterte Einstellungen wählen Sie Ligationstemperatur, Dauer, Ligase-Typ und Vektorbehandlungsoptionen.
  6. Klicken Sie auf „Berechnen“, um die empfohlene Einfügemenge und das Reaktionssetup zu generieren.

Häufig gestellte Fragen

Was ist das optimale molare Verhältnis von Vektor zu Insert?

Für klebrige Endligationen wird allgemein ein Verhältnis von 1:3 oder 1:5 empfohlen. Für stumpfe Endligationen kann ein höheres Verhältnis (z. B. 1:5 bis 1:10) die Effizienz verbessern.

Warum wird die Dephosphorylierung des Vektors empfohlen?

Die Dephosphorylierung (unter Verwendung von CIP, SAP oder antarktischer Phosphatase) verhindert die Selbstligierung des Vektors und reduziert unerwünschte Hintergrundkolonien.

Welche Ligationbedingungen sollte ich verwenden?

  • 16°C für 4 Stunden – Standardbedingung für T4 DNA-Ligase.
  • Raumtemperatur für 15 Minuten – Geeignet für Quick Ligase.
  • Über Nacht bei 16°C – Empfohlen für herausfordernde Ligationen oder stumpfes Klonen.

Wie kann ich die Ligationseffizienz verbessern?

  • Stellen Sie das korrekte molare Verhältnis für Vektor und Insert sicher.
  • Verwenden Sie frische DNA-Ligase und Puffer.
  • Optimieren Sie die Ligationbedingungen (Temperatur und Dauer).
  • Bestätigen Sie die Anwesenheit des Inserts durch Gelelektrophorese vor der Ligation.

Warum diesen Rechner verwenden?

Dieser Ligation Rechner vereinfacht die Einrichtung von DNA-Ligationen und hilft Forschern, die richtigen Mengen an Vektor und Insert für effizientes Klonen zu bestimmen. Durch die Automatisierung von Berechnungen und das Anbieten von Optimierungstipps spart er Zeit und erhöht die Erfolgsquote von Ligationsexperimenten.