Ligation-Rechner

Kategorie: Biologie
- März 20, 2025
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Vektor-DNA

Insert-DNA

Ligationsreaktionsaufbau

Empfohlene Insert-Menge
8.3 ng
0.33 μL Insert-Lösung
Vektormenge
50 ng
1 μL Vektor-Lösung verwendet
Insert:Vektor-Verhältnis
3:1 (molar)
Optimal für Standardklonierung

Kompletter Reaktionsaufbau

Komponente Volumen (μL) Endmenge
Vektor-DNA (50 ng/μL) 1.0 50 ng
Insert-DNA (25 ng/μL) 0.33 8.3 ng
10× T4-DNA-Ligase-Puffer 2.0 1×
T4-DNA-Ligase 1.0 400 U
Nukleasefreies Wasser 15.67 Bis 20 μL
Gesamtvolumen 20.0

Optimierungstipps

Basierend auf Ihren Eingabeparametern hier einige Empfehlungen:

  • Für 5'-klebrige Enden mit einem Vektor:Insert-Verhältnis von 1:3, inkubieren Sie bei 16°C für 4 Stunden.
  • Die CIP-Behandlung des Vektors reduziert den Hintergrund durch Selbstligation.
  • Wenn die Transformationseffizienz niedrig ist, versuchen Sie, das Insert:Vektor-Verhältnis auf 5:1 zu erhöhen.
  • Für glatte Enden erhöhen Sie die Ligasekonzentration und verlängern Sie die Ligationszeit.
  • Inaktivieren Sie die Ligase durch Erhitzen bei 65°C für 10 Minuten vor der Transformation für beste Ergebnisse.

Über DNA-Ligation

  • Die DNA-Ligation umfasst das Verbinden von DNA-Fragmenten durch die Bildung von Phosphodiesterbindungen.
  • T4-DNA-Ligase benötigt ATP und Mg²⁺, um ordnungsgemäß zu funktionieren (bereitgestellt im Ligationspuffer).
  • Klebrige Enden sind effizienter als glatte Enden.
  • Vektor:Insert-Molarverhältnisse liegen typischerweise zwischen 1:3 und 1:5 für Standardklonierung.
  • Höhere Insert:Vektor-Verhältnisse (3:1 bis 10:1) werden für glatte Enden oder größere Inserts empfohlen.
  • Die Dephosphorylierung von Vektoren (mit CIP, SAP usw.) verhindert die Selbstligation des Vektors.
  • Schnelligationssysteme können die Ligationszeit auf 5-15 Minuten bei Raumtemperatur reduzieren.

Formel für die Einfügemenge (ng):

\[ \text{Einfügemenge ng} = \left( \frac{\text{Vektor ng} \times \text{Einfügelänge in kb}}{\text{Vektorlänge in kb}} \right) \times \left( \frac{\text{Einfügemolen}}{\text{Vektormolen}} \right) \]

Was ist der Ligation Rechner?

Der Ligation Rechner ist ein Werkzeug, das Forschern hilft, die geeignete Menge an Vektor- und Insert-DNA für eine erfolgreiche Ligation zu bestimmen. Die DNA-Ligation ist ein kritischer Schritt im molekularen Klonen, bei dem ein DNA-Insert mit einem Plasmidvektor unter Verwendung eines Enzyms namens DNA-Ligase verbunden wird.

Wie funktioniert es?

Dieser Rechner ermöglicht es den Benutzern, Details zu ihrem Vektor und Insert einzugeben, einschließlich Länge und Konzentration. Basierend auf dem gewählten molaren Verhältnis berechnet er die erforderliche Menge an Insert-DNA, um eine optimale Ligation zu erreichen.

Wichtige Funktionen

  • Berechnet molare Verhältnisse von Vektor zu Insert für verschiedene Klonierungsszenarien.
  • Unterstützt sowohl standardisierte als auch benutzerdefinierte molare Verhältnisse.
  • Gibt Empfehlungen für Ligationbedingungen basierend auf klebrigen oder stumpfen Enden.
  • Beinhaltet Optimierungstipps zur Verbesserung der Ligationseffizienz.

Wie benutze ich den Rechner?

  1. Geben Sie die Vektorlänge (bp) und Konzentration (ng/μL) ein.
  2. Geben Sie die Einfügelänge (bp) und Konzentration (ng/μL) ein.
  3. Wählen Sie das gewünschte molare Verhältnis von Vektor zu Insert (z. B. 1:3, 1:5).
  4. Geben Sie das gesamte Reaktionsvolumen an (z. B. 20 μL).
  5. Für erweiterte Einstellungen wählen Sie Ligationstemperatur, Dauer, Ligase-Typ und Vektorbehandlungsoptionen.
  6. Klicken Sie auf „Berechnen“, um die empfohlene Einfügemenge und das Reaktionssetup zu generieren.

Häufig gestellte Fragen

Was ist das optimale molare Verhältnis von Vektor zu Insert?

Für klebrige Endligationen wird allgemein ein Verhältnis von 1:3 oder 1:5 empfohlen. Für stumpfe Endligationen kann ein höheres Verhältnis (z. B. 1:5 bis 1:10) die Effizienz verbessern.

Warum wird die Dephosphorylierung des Vektors empfohlen?

Die Dephosphorylierung (unter Verwendung von CIP, SAP oder antarktischer Phosphatase) verhindert die Selbstligierung des Vektors und reduziert unerwünschte Hintergrundkolonien.

Welche Ligationbedingungen sollte ich verwenden?

  • 16°C für 4 Stunden – Standardbedingung für T4 DNA-Ligase.
  • Raumtemperatur für 15 Minuten – Geeignet für Quick Ligase.
  • Über Nacht bei 16°C – Empfohlen für herausfordernde Ligationen oder stumpfes Klonen.

Wie kann ich die Ligationseffizienz verbessern?

  • Stellen Sie das korrekte molare Verhältnis für Vektor und Insert sicher.
  • Verwenden Sie frische DNA-Ligase und Puffer.
  • Optimieren Sie die Ligationbedingungen (Temperatur und Dauer).
  • Bestätigen Sie die Anwesenheit des Inserts durch Gelelektrophorese vor der Ligation.

Warum diesen Rechner verwenden?

Dieser Ligation Rechner vereinfacht die Einrichtung von DNA-Ligationen und hilft Forschern, die richtigen Mengen an Vektor und Insert für effizientes Klonen zu bestimmen. Durch die Automatisierung von Berechnungen und das Anbieten von Optimierungstipps spart er Zeit und erhöht die Erfolgsquote von Ligationsexperimenten.